恶性肿瘤病因

CDB

摘要：目的:探索人类癌症（恶性肿瘤）病因。用盐酸、磷酸、乙酸、乳酸单独或分别与葡萄糖混合物模拟人类在自然生活环境下诱导大鼠和兔的肺癌实验。方法:（一）将SD大鼠雄性30只随机分为5组，每组6只，葡萄糖与生理盐水混合物为对照组，单次给药后观察4-14天,取肺组织病理学检查。（二）将新西兰白兔雄性50只随机分为10组，每组5只，葡萄糖与生理盐水混合物为对照组，单次给药后观察7天，取肺组织病理学检查。结果:单次肺注射所述酸或分别与葡萄糖混合物各组都可以诱导大鼠和兔肺癌变，与葡萄糖和生理盐水混合物对照组相比各种酸及糖酸混合物致癌效果确切。结论：在本实验条件下，所述酸及糖酸混合物都可以诱导正常肺组织癌变。

关键词:癌症、酸、糖、炎症、黏附分子

人类对疾病的认识是随社会发展和科技进步不断提高的，当前许多重大疾病和慢性病几乎都难以治愈，其中大部分疾病只能维持、缓解，控制缓慢发展，从全球来看，癌症、心脑血管疾病、糖尿病等是除传染性疾病以外致死率最高也是最常见的疾病，医药、科研人员都在积极努力突破现有技术，期待早日实现完全彻底解决这些危及人类生命的重大疾病和慢性病。近百年来，虽然对各种疾病的研究和认识不断提高，但主要的病因问题还是没有解决，找不到病因，只能对症治疗，如果从病因学方面入手就会很快得以解决，只有明确疾病的发病机制，才能有效治愈疾病。癌症、心脑血管疾病、糖尿病是世界发病率最高的常见病，这样大的发病概率我们应该能找出规律突破病因，为药物筛选和临床研究奠定基础。采用准确的完全模拟人类在正常生活环境条件下制作的动物疾病模型是决定药物筛选的成败关键所在，同时对人类预防和治愈这些疾病发挥重要作用。

癌症在近年来爆发式增长，如此大概率发病，必然会有共性条件存在，水、空气、糖、酸、碱、盐是人类生命中不可缺少的物资，本研究在炎症[1]诱导下以多种酸和糖酸混合物诱导大鼠和兔肺组织癌变来揭示癌症病因。

实验1.

诱导剂诱导大鼠形成肺癌的研究

1.实验目的：

试验并验证诱导剂不同时间点，在大鼠模型上诱导形成肺部癌变的情况。

2. 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1主要实验试剂：

2.1.2主要实验设备：

2.2实验动物

种属&品系：SD大鼠；

动物等级：SPF级；

性     别：雄性；

实验动物来源：辽宁长生生物技术股份有限公司；

日龄或体重：200g±20g；

数    量：30只；

2.3实验方法

2.3.1实验动物饲养：

饲养室温度18-22℃，湿度40-70%，换气次数不少于20次/h，每笼饲养不超过6只，光照12小时明暗交替。动物给予合格的鼠料，动物均自由摄食。动物给予纯化水，用饮水瓶供应，自由摄水。

2.3.2诱导注射:

实验动物分组及给药情况如下：

采用随机分组法，根据体重将动物分为5组，每组6只动物。各组动物给于诱导剂情况及剂量如下表：

诱导剂制备方法：1g葡萄糖加入到0.375ml盐酸中，低温加热搅拌至无色透明状黏稠性液体。

异氟烷将大鼠麻醉，在大鼠的左侧腋窝剃毛备皮，碘伏消毒，用微量注射器吸取50uL造模药物，大鼠侧卧，左侧向上，左前肢自然弯曲，在大鼠左前肢肘关节侧后方的肋骨之间与水平面夹角为45°进针，深度为1cm，即可进入肺部，注射50uL造模药物，分别在不同时间点检测肺癌模型形成情况。

2.3.3病理检测：

静脉注射水合氯醛，麻醉处死大鼠，剖开胸腔，根据肺给药部位，观察给药部位病变，并取材固定，经程序化脱水、包埋、切片、摊片、烤片，入二甲苯中脱蜡5分钟×3次，100%乙醇2分钟×2次，自来水冲洗2分钟，苏木素染色3分钟，自来水2分钟，1%盐酸酒精溶液分化2秒，自来水冲洗2分钟，返兰液1秒，自来水2分钟，伊红染色10秒，50%乙醇脱水10秒，70%乙醇脱水10秒，无水乙醇1分钟×2次，二甲苯中透明3分钟×2次，中性树胶封片。显微镜拍照，阅片。

2.4实验结果

各实验组HE病理染色结果如下：

图1 对照组1病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5、6； 实验为14d后取材，各大鼠肺组织病理学检测如下：1： 未见癌、轻度炎症；2： 未见癌、出血；3：未见癌、轻度炎症；4： 未见癌、轻度炎症；5： 未见癌、轻度炎症；6：未见癌、轻度炎症；

图2 对照组2病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5；实验方案原预计第14d取材，大鼠注射后状态不佳，其中第6只提前死亡，预期次配方不能在大鼠健康情况下稳定诱导肺部癌变，随提前至36h取材，结束实验，以下为本组大鼠病理分析结果：1：可疑癌；2： 未见癌；3：未见癌；4： 未见癌；5： 未见癌；

图3 实验组1病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5、6；以下为诱导剂注射96h（4d）后病理分析结果：1： 腺癌，癌腺体少；2：腺癌，穿刺点在肺尖处；3： 腺癌，癌腺体少；4： 腺癌，癌腺体多；5： 腺癌，癌腺体多；6： 腺癌，穿刺点浅，肺膜下癌；

图4 实验组2病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5、6；以下为诱导剂注射168h（7d）后病理分析结果：1： 腺癌；2： 腺癌；3： 腺癌；4： 腺癌；5： 可疑腺癌，穿刺点直径约3毫米；

6： 腺癌；

图5 实验组3病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5、6；以下为诱导剂注射336h（14d）后病理分析结果：1：腺癌，肉芽肿性炎症；2： 未见癌，肉芽肿性炎症，穿刺点表浅；3： 未见癌，穿刺点2毫米；4： 未见癌，未见穿刺点；5： 腺癌，轻度炎症；6： 腺癌，未见明确穿刺点，肺内出血严重，肺膜下癌；

3 结  论

由本研究可知，对照组1葡萄糖和生理盐水混合物未见癌变，对照组2盐酸与生理盐水混合物，刺激性较强，36小时全部取材，未见癌变。而诱导剂在优化配比之后，实验组在第4d即检测出注射区域出现癌变，且7d及14d病理检测进一步证实了诱导剂诱导大鼠肺部出现腺癌癌变的效果。证明该种方式配制的诱导剂可在短期内诱导大鼠肺部癌变。

实验2.

诱导剂诱导兔肺组织形成癌变的研究

1.实验目的：

试验并验证诱导剂不同时间点，在实验兔模型上诱导形成肺部癌变的情况。

2. 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1主要实验试剂：

2.1.2主要实验设备：

2.2实验动物

种属&品系：新西兰白兔；

动物等级：SPF级；

性     别：雄性；

实验动物来源：中国食品药品检定研究院；

日龄或体重：1.8~2.2kg；

数    量：50只；

2.3实验方法

2.3.1实验动物饲养：

饲养室温度18-22℃，湿度40-70%，换气次数不少于20次/h，每笼饲养不超过2只，光照12小时明暗交替。动物给予合格的饲料，动物均自由摄食。动物给予纯化水，用饮水瓶供应，自由摄水。

2.3.2诱导注射:

模型制备方法如下：采用随机分组法，根据体重将动物分为10组，每组5只动物。各组动物给于诱导剂情况及剂量如下表：

将实验兔侧卧保定，左侧向上，在左侧腋窝剃毛备皮，碘伏消毒，从肋骨下缘向前数其肋骨，在第6-7肋骨之间，距离脊柱2指宽的位置进针，1mL注射器吸取造模药物300uL，进针深度为注射器针头的全部，约2.5cm，即可将药物注射入肺部。

2.3.3病理检测：

静脉注射水合氯醛，麻醉处死实验兔，剖开胸腔，根据肺给药部位，观察给药部位病变，并取材固定，经程序化脱水、包埋、切片、摊片、烤片，入二甲苯中脱蜡5分钟×3次，100%乙醇2分钟×2次，自来水冲洗2分钟，苏木素染色3分钟，自来水2分钟，1%盐酸酒精溶液分化2秒，自来水冲洗2分钟，返兰液1秒，自来水2分钟，伊红染色10秒，50%乙醇脱水10秒，70%乙醇脱水10秒，无水乙醇1分钟×2次，二甲苯中透明3分钟×2次，中性树胶封片。显微镜拍照，阅片。

2.4实验结果

各实验组HE病理染色结果如下：

图1 试验组1病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5； 实验为14d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：未见癌，中度炎症；2：未见癌，轻度炎症；3：未见癌，轻度炎症；4：未见癌，轻度炎症；5：未见癌，轻度炎症；

图2 试验组2病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：腺癌；3：腺癌；4：腺癌；5：腺癌；

图3 试验组3病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为2、3、4、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：大约12小时死亡未及时取材；2： 腺癌；3：腺癌；4：未见癌，穿刺点周围见肺泡上皮不典型增生；5：腺癌；

图4 试验组4病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：腺癌；3：腺癌；4：腺癌；5：未见癌，支气管腔内炎性分泌物，重度炎症；

图5 试验组5病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：腺癌，肿瘤坏死伴多核巨细胞反应；3：未见癌，重度炎症；4：未见癌，轻度炎症 未见明确穿刺点；5：腺癌，见肿瘤细胞坏死；

图6 试验组6病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：未见癌，未见穿刺点；3：腺癌；4：大约16小时死亡未及时取材；5：腺癌；

图7 试验组7病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：未见癌，穿刺点明确（46小时死亡）；2：未见癌，轻度炎症；3:腺癌；4：腺癌；5：腺癌；

图8 试验组8病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：未见癌 轻度炎症，未见明确穿刺点；2：腺癌；3：腺癌，局灶见肺泡上皮不典型增生；4：未见癌，局灶见肺泡上皮不点型增生；5：腺癌；

图9 试验组9病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：腺癌，膈肌萎缩，纤维组织增生；3：腺癌；4：腺癌；5：腺癌；

图10 试验组10病理染色结果（10×10）

注：自左向右，自上而下依次为1、2、3、4、5； 实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：未见癌；2：腺癌；3：腺癌；4：腺癌；5：腺癌，见肿瘤坏死；

3 结  论

由本研究可知，除实验组1溶剂对照组外，其余各组组方均可以在7d内诱导出癌变，各组未见癌变的可能是穿刺注射点表浅，或刺穿肺部注入胸腔等其它人为因素，更进一步的兼顾安全性及诱导效率实验组2组方（生理盐水与浓盐酸混合液（体积比5:3））及实验组9组方（50%葡萄糖注射液与乳酸混合液（体积比10:1））最优。组方中加入葡萄糖可有效降低局部的急性刺激程度，减少实验动物死亡。

讨  论

盐酸、磷酸、乙酸、乳酸单独或分别与葡萄糖混合物是否致癌，尚未发现明确报道。本研究用SD大鼠和新西兰兔两种动物致癌实验，发现单次给予大鼠50 uL,兔100 uL、300 uL、600 uL酸及糖酸混合物可导致大鼠和兔肺癌变。在本研究单次注射给予不同的酸及糖酸混合物仅在96小时即可见大鼠肺组织发生明确癌变（在预实验中最快注射90小时可见腺癌）， 7天和14天时大鼠和兔肺癌变也是稳定的。在本研究中可见穿刺点都见炎症和/或坏死组织，多个模型病理图片可见注入的液体在肺组织间向周围浸润，层次清晰，依次是注射点位坏死、水肿、纤维组织增生、伴癌、癌组织形成，癌变处也见不同程度坏死，坏死处并非注射液体形成刺激性点位坏死，从液体注入至癌组织形成这个过程一般在96小时完成，而后肿瘤组织继续生长，从正常肺组织到癌变乃至肿瘤的形成时间是短暂的。综上所述，盐酸、磷酸、乙酸、乳酸单独或分别与葡萄糖混合物可以导致大鼠和兔肺癌变。

本研究期望通过动物实验来探索人类癌症病因。依上述实验，我们可以推理，当不同的酸进入人体内后除机体正常代谢需要外，还有部分会在相应条件下与葡萄糖发生反应，生成一种醛类和含有其它尚未明确组分的粘稠物，其附着在不同组织细胞外膜，通常称其为细胞黏附分子[2]，研究发现，这种细胞黏附分子在上皮来源的多种肿瘤中都出现高表达，当组织出现炎症，并附着在细胞外膜的细胞黏附分子达到阈值时就会使炎症点位细胞坏死，附着在细胞外膜的细胞黏附分子形成堆积，更加剧细胞坏死及浸润正常组织细胞，使正常组织细胞形成癌变，其细胞分裂增殖后，细胞黏附分子同样附着在增殖后的细胞外膜。因此，本研究认为多种酸进入人体与葡萄糖反应生成的粘稠物（细胞黏附分子）在炎症诱导下是导致不同组织细胞癌变的主要原因，既癌症（恶性肿瘤）病因。

参考文献：

[1]张学敏,李慧艳,周涛,等. 炎症诱发肿瘤的关键调控机制研究[Z]. 中国人民解放军军事医学科学院. 2013.

[2]于国龙. EpCAM基因启动子区CpG岛甲基化状态与基因表达关系研究[D]. 广东:中山大学,2006.